Работа с лабораторными животными в виварии. Использование лабораторных животных в токсикологическом эксперименте (методические рекомендации)

Под лабораторными животными понимаются любые позвоночные, которые применяются для научных исследований, обучения или испытаний. Условно их делят на традиционные, т. е. наиболее часто используемые в экспериментах, и нетрадиционные, которые нечасто используются в биомедицинских исследованиях. К традиционным относятся лабораторные мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, кошки, собаки, обезьяны и др. К нетрадиционным - песчанки, суслики, рыбы, опоссумы, броненосцы и др.
Зоогигиенические требования к устройству вивария. Помещение, где под контролем специалистов лабораторного животноводства осуществляется содержание, размножение животных, используемых для экспериментальных (научных) или учебных целей, а также для практики здравоохранения, называют виварием (от лат. \ivus - живой).
Выбор технологии содержания и разведения лабораторных животных, а также планирование и проектирование помещений для животных определяется микробиологической категорией (статусом) животных.
Помещения, предназначенные для содержания животных, должны обеспечивать им нормальную жизнедеятельность. Любые отклонения от нормы в среде, окружающей животное, немедленно сказываются на его внутреннем состоянии. Ого неизбежно приводит к искажению результатов научных исследований.
Таким образом, требования, предъявляемые к помещениям для животных, теснейшим образом связаны с получением объективных (достоверных) результатов экспериментов и их воспроизводимости в будущем.
Правильно спроектироваяный, хорошо сконструированный, построенный и содержащийся в должном состоянии виварий составляет важный элемент правильного содержания и использования животных и облегчает эффективную, экономичную и безопасную эксплуатацию. Конструкция и размер вивария определяются масштабом исследовательской работы с животными в данном научном учреждении, видом содержащихся в нем животных, расположением вивария по отношению к другим здания» и географической зоной, где оно находится.
Необходимым требованием обеспечения правильного содержания животных и охраны здоровья обслуживающего персонала является отделение помещений, где содержатся животные, от служебных помещений.
Продуманное планирование позволяет разместить виварий рядом или вблизи с научно-исследовательской лаборатори-

1 - помещение для приема животных; 2 - гсмеще- ние для приемного контроля животных; 3 - поие- щение для наблюдения животных; 4 - административное и вспомогательное помещение: 5 - раздевалка; 6 - санузел; 7 - чистый коридор; 8 - склад 9 - «предпроцедурное» помещение; 10 - помещение для содержания животных: 11 - запасное подготовительное помещение; 12 - помещение для койки; 13 - машинное помещение; 14- помещение для сжигания отходов; 15 - грязный коридор; 1Б- помещение для стерилизадии.

ей, разделив их барьерами типа тамбура, коридора или этажа. Виварий должен состоять из: 1) помещения для приема животных; 2) карантинного отделения;

1. комнат для содержания животных;
2. манипуляционной; 5) операционной; 6) ветеринарно-диагностического кабинета и других вспомогательных служб.

помещениями, и его не следует переносить из одного помещения в другое. Сам инвентарь следует регулярно чистить; причем он должен быть изготовлен из коррозионно-устойчивых материалов.
Профилактика заболеваний является важнейшим элементом ветеринарного обеспечения животных. Эффективные программы профилактических мероприятий способствуют повышению научной ценности животных, поскольку они позволяют сохранить их здоровье и свести до минимума вероятность изменения их состояния, обусловленную заболеваниями. Программы профилактических мероприятий включают различные комбинации правил, процедур и методов, связанных с карантином и стабилизацией здоровья животных, а также с раздельным содержанием животных в зависимости от вида, источника поступления и состояния здоровья.
Карантин предполагает содержание вновь поступивших животных отдельно от животных, уже находящихся в виварии, до полного определения состояния здоровья и, возможно, микрофлоры вновь поступивших животных.
К раздельному содержанию животных одного и того же вида можно прибегать в тех случаях, когда животные, поступившие из разных центров или источников, являются носителями различных патогенных микроорганизмов (Сидорчук А. А., Глушков А. А., 2002).
После карантина (мыши, крысы - 10 суток, собаки - 30 суток, остальные животные - 21 сутки) животных маркируют (мышей и крыс - окраской, кроликов - надеванием на ухо бирки с номером, птиц - кольцеванием), осматривают, взвешивают, замеряют температуру, частоту дыхания, пульс. Если отклонения от нормы отсутствуют, животное берут в опыт и переводят в специальное помещение. Вышедших из опыта животных подвергают безболезненному умерщвлению (эвтаназии). Мелких животных умерщвляют декапитацией или ингаляцией хлороформа (эфира), кроликов - воздушной эмболией, крупных животных - электрическим током.
Оборудование вивария и микроклимат. Кондиционирование воздуха является эффективным средством регулирования температуры и влажности воздуха. Конструкция систем обогрева, вентиляции и кондиционирования воздуха должна обеспечивать их надежность, удобство эксплуатации и экономию электроэнергии.
Относительная влажность обычно поддерживается в пределах 30-70% в течение всего года. На случай частичного отказа системы обогрева, вентиляции и кондиционирования воздуха необходимо предусмотреть аварийную систему, которая обеспечила бы поддержание уровней температуры и влажности в приемлемом диапазоне.
В некоторых случаях рекомендуется использование фильтров для очистки воздуха, поступающего в помещения для содержания животных, проведения экспериментальных процедур и хирургических манипуляций.
Электрическая система должна быть безопасной и обеспечивать адекватное освещение, иметь достаточное количество розеток и гарантировать достаточную силу тока для специального оборудования. На случай отключения электричества необходимо предусмотреть альтернативный или аварийный источник электроэнергии для обеспечения функционирования критически важных систем или вспомогательных систем (например, морозильников, вентилируемых стеллажей и изоляторов) в помещениях для животных, операционных блоках и других важных зонах.
Зоны для хранения отходов должны быть отделены от других хранилищ. Для хранения трупов животных и их тканей обязательно иметь холодное помещение
С холодильнии камерии, отделенное нт других холодных комнат; в таком помещении температура не должна превышать 7°С, чтобы исключить возможность разложения отходов и трупов животных.
При эксплуатации вивария большое значение имеет регулирование уровня шума. В отношении защиты от шума кирпичные стены представляются более эффективными, чем металлические или гипсовые, поскольку благодаря своей плотности они обладают меньшей звукопроницаемостью. В некоторых ситуациях с целью уменьшения уровня шума можно использовать поддающиеся обработке звукоизолирующие материалы, прикрепляемые к стенам или потолкам. Определенное внимание следует уделить снижению уровня шума, генерируемого работающей аппаратурой, особенно в ультразвуковом диапазоне.
В виварии необходимо предусмотреть специальную единую зону для санитарной обработки клеток и вспомогательного оборудования. Обычно для мойки клеток рекомендуется использовать механические моечЕые машины, которые следует выбирать с учетом типа клеток и другого оборудования.
Первичное ограждение (обычно клетка, загон или стойло) ограничивает непосредственную среду обитания животного. Приемлемые первичные ограждения:

• удовлетворяют нормальным физиологическим и поведенческим потребностям животного, включая мочеиспускание и дефекацию, поддержание температуры тела, нормального характера движений и поз, а также, по показаниям, размножение;
• обеспечивают социальные взаимоотношения и установку иерархических отношений внутри или между ограждениями;
• дают возможность животным оставаться чистыми и сухими (в соответствии с потребностями данного вида);
• ооеспечивают одслошпую вентиляцию; обеспечивают животным доступ к пище и воде, а также позволяют легко заполнять, менять, обслуживать и чистить посуду, где содержится корм и вода;
• обеспечивают безопасность животного, т. е. исключают возможность его бегства, случайного попадания (целиком или конечностями) в щели или застревания между противоположными поверхностями;
• не имеют острых краев или выступов, которые могут травмировать животное;
• дают возможность наблюдать за животными, практически не вызывая их беспокойства.

Шум, источником которого являются животные и обслуживающий их персонал, служит непременной характеристикой действующего вивария. Поэтому при проектировании и эксплуатации вивария необходимо учитывать возможность регулирования уровня шума.
Животных, создающих много шума, например собак, свиней, коз и приматов, следует помещать на расстоянии от тихих животных, например грызунов, кроликов и кошек. Воздействие шума с уровнем интенсивности, превышающим 85 дБ, может оказать влияние как на слуховой аппарат, так и на другие органы. Многие виды животных обладают способностью слышать звуки такой частоты, которые не доступны человеку, поэтому нужно обращать особое внимание на потенциальное воздействие аппаратуры, например видеоаппаратуры, и материалов, продуцирующих шум в диапазоне слышимости находящихся поблизости животных. В виварии нельзя пользоваться радиоаппаратурой, будильниками и другими приборами, создающими шум, если только они не входят в состав утвержденной экспериментальной аппаратуры или оборудования, предназначенного для обогащения среды обитания животных.
В зависимости от вида животных и направления их использования структура среды обитания должна включать планки для отдыха, полки или насесты, игрушки, кормушки и поилки, материал для строительства гнезд и нор, туннели, качели и другие предметы, которые предоставляют животным большие возможности для проявления видоспецифичного поведения, принятия нормальных поз и способствуют их благополучию.
Размещение и транспортировка животных. При размещении животных необходимо стремиться к тому, чтобы создать максимально благоприятные условия для видоспецифичного поведения и свести до минимума стрессовое воздействие. Для социальных видов животных такое требование обычно предполагает их размещение совместимыми парами или группами. Персонал, осуществляющий уход за животными, должен выработать стратегию наиболее целесообразного размещения животных, обеспечивающего их здоровье и благополучие, а также соответствующего задачам эксперимента.
Мышей, морских свинок, кроликов, крыс, хомяков, кур размещают в находящихся на стеллажах клетках, строго соблюдая плотность посадки, собак и обезьян - в отдельных кабинах, кошек - в вольерах. Дно клеток покрывают тонким слоем опилок или стружек, предварительно простерилизованных при 150-180°С в течение 15-20 минут. В поилках клеток должна быть питьевая вода, отвечающая требованиям СанПиН. Необходимо соблюдать нормы и режим кормления. Посуду для воды и кормов следует регулярно дезинфицировать, мыть и ополаскивать.
Потребности животных в занимаемом пространстве определяются разными факторами; при этом учет только массы или площади поверхности тела животного является недостаточным.
Для некоторых видов животных более благоприятным является наличие перегородок (например, грызуны, для которых характерен тигмотаксис), укрытий или сложной структуры клеток (например, кошки и шимпанзе), а не простое увеличение площади (Рахманов А. И., 2002).
Такие показатели состояния животных, как здоровье, размножение, рост, поведение, активность и использование ими пространства могут служить оценкой соответствия их размещения. Как минимум, животное должно иметь достаточно места, чтобы поворачиваться и принимать нормальные позы, иметь свободный доступ к кормушкам и поилкам, а также достаточное и свободное (покрытое чистой подстилкой) пространство, где

оно может удобно расположиться и отдыхать. В клетке для кошек необходимо установить приподнятую над полом платформу для отдыха. Такие платформы или выступы часто желательно устраивать для собак и приматов. Пространство, занимаемое кормушками, поилками, устройствами для туалета или другими приспособлениями, которые не предназначены для передвижения или отдыха, не должно входить в площадь пола.
Высота ограждений может иметь большое значение для нормального поведения и приспособления некоторых видов животных. При расчете высоты клеток нужно принимать во внимание типичные позы животного и достаточное место для обязательных элементов клетки, например кормушек, поилок, ванн с водой. Приматы некоторых видов используют вертикальные пространства клетки в большей степени, чем ее пол. Для их хорошего самочувствия важно предоставлять им возможность высоко взбираться на ветку и использовать вертикальное пространство, достаточное для размещения всего тела над полом клетки.
При расчете производственных площадей необходимо исходить из следующих нормативов размещения животных в клетках (табл. 55).
В табл. 56 приводятся рекомендуемые размеры клеток для других обычно используемых в лабораторных экспериментах животных. Эти данные основаны на потребностях животных при индивидуальном содержании. Размеры клеток могут быть пересмотрены при необходимости обогащения среды обитания или содержания животных с массой, превышающей указанную в таблице. При групповом содержании животных площадь общего пространства не является обязательно суммой величин, рекомендуемых для индивидуального содержания животных. При групповом содержании животных расчеты должны основываться на потребностях и поведенческих характеристиках животных данного вида, совместимости особей, количестве животных, а также задачах, которые ставятся при их размещении.
Высших обезьян массой более 50 кг лучше содержать в помещениях из кирпича, бетона и в проволочных ограждениях, а не в обычных клетках.
Все животные должны приобретаться законным путем. Если собаки и кошки поступают от дилеров или станций отлова животных, то таких животных следует осмотреть на предмет их возможной идентификации. Подобная проверка может выявить факт, что данное животное было домашним; в таком случае следует установить его владельца.
Использование специально выведенных экспериментальных животных возможно, если оно диктуется задачами исследования, обучения или испытаний.
Любые перемещения животных, в том числе внутри вивария, следует должным образом координировать с тем, чтобы свести до минимума время перевозки

и риск передачи зоонозов, защитить животных от воздействия экстремальных условий окружающей среды, исключить слишком большую скученность животных, обеспечить при необходимости их доступ к корму и воде и предохранить от физических травм. Связанный с транспортировкой стресс является неизбежным, однако он может быть сведен до минимума при должном внимании к перечисленным выше факторам. Каждую партию животных необходимо проверять на соответствие требованиям получателя и на наличие клинических признаков заболеваний, при этом животных следует помещать в карантин и стабилизировать их состояние с помощью процедур, соответствующих данному виду и условиям.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ

1. Какие способы содержания собак и ухода за ними вы знаете?
2. В чем заключаются особенности содержания кошек и ухода за ними?
3. Какие гигиенические требования предъявляются при транспортировке собак и кошек?
4. В чем заключается гигиена выращивания молодняка собак и кошек?
5. Какие гигиенические требования к кормлению и поению собак и кошек?
6. Какие требования предъявляют к выбору места для вивария и его устройству?
7. В чем заключаются зоогигиенические требования к вивариям?
8. Как обеспечивается оптимальный микроклимат в виварии?
9. Какие санитарно-гигиенические требования предъявляют при содержании лабораторных животных?

Рис. 1. Операция выделения и пересечения ветвей возвратных нервов для создания беззвучного лая у собак.
1-левая доля щитовидной железы; 2 - возрастная ветвь блуждающего нерва; 3 - левая грудино-подъязычная мышца (оттянута крючком); 4 - пищевод; 5-трахея.

Комната, где располагаются клетки с животными, должна хорошо вентилироваться, относительная влажность воздуха должна быть в пределах 40-45%. Даже при наличии приточно-вытяжной вентиляции с целью снижения содержания в воздухе аммиака и продуктов жизнедеятельности животных рекомендуется применять торфяные подстилки или опилки с добавлением суперфосфата. Процесс уборки клеток может быть автоматизирован; уборка осуществляется 1-2 раза в сутки.
На передней стенке клетки устанавливают кормушку, автопоилку и вешают табличку, на которую заносят основные данные о животном, виде оперативного вмешательства и т. д.
Кроликов и морских свинок нередко содержат вне помещений вивария. Для этого используют клетки, располагая их в несколько ярусов, под общей крышей. Наружное содержание способствует выращиванию здоровых, более стойких к различным заболеваниям кроликов и большей частью распространено в питомниках.

Цель: изучить правила техники безопасности, требования к подготовке, организации и проведению экскурсий в природе, научиться планировать, проводить и фиксировать наблюдения, ознакомиться с основными методами зоологических исследований и методами коллектирования позвоночных животных.

Оборудование и материалы: рабочая программа учебной практики по зоологии позвоночных, график учебного процесса обучения студентов специальности 050102 «Биология» в текущем учебном году, правила техники безопасности, приборы для наблюдений за погодой (флюгер, нефоскоп, барометр-анероид, гидрометр, термометры, снегомерная рейка, осадкомер Третьякова, объемный снегомер, ручной анемометр), компас, GPS-навигатор, шагомер, курвиметр, бинокль, планшет, карандаши, линейка, рулетка, дневник полевой практики, журнал полевой практики, основная и дополнительная литература по учебной практике.

Работа 1. Изучение рабочей программы учебной практики по зоологии позвоночных

Работа 2. Изучение правил по технике безопасности в период прохождения учебной практики по зоологии позвоночных

Изучите правила техники безопасности, составьте конспект.

Ознакомьтесь с состоянием окружающей среды в Вологодской области, используя «Атлас…» (1995), и с ландшафтно-эпизоотическим районированием территории Вологодской области (Радченко, 2007), составьте список природно-очаговых особо опасных заболеваний, выясните в медпункте ЧГУ и запишите схему прививок от клещевого энцефалита для студентов, поступивших в университет.

Ознакомьтесь со следующими природно-очаговыми заболеваниями и их профилактикой: туляремия, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС), лептоспироз, энцефалит клещевой (весенне-летний), боррелиоз системный клещевой (болезнь Лайма).

Работа 3. Изучение требований, предъявляемых к подготовке, организации и проведению экскурсий

Ознакомьтесь с материалом работы и ответьте на вопросы: какие этапы выделяют в экскурсионной работе? Какие работы выполняют педагог и обучаемый на каждом этапе?

Основной формой работы на полевой практике по зоологии позвоночных служат экскурсии в природу. Они имеют важное об­разовательное значение. Под руководством преподавателя студен­ты-биологи учатся наблюдать животных в естественной для них обстановке, знакомятся с фауной позвоночных животных конк­ретного района. При правильной организации экскурсий студенты смогут научиться узнавать животных по внешнему облику, по голосам, по сле­дам деятельности, устанавливать их биотопические и трофичес­кие связи, место и роль в биоценозах. На экскурсиях студенты приобретают навыки наблюдений за животными, навыки проведения зоологических экскурсий, которые в дальнейшем смогут приме­нить в самостоятельной работе при выполнении курсовых и дипломных работ, а также в своей педагогической работе со школьниками.

Экскурсии в природу проводятся с группами студентов из 10 – 12 человек. Это количество обучающихся на одного руководителя предусмотрено техникой безопасности при проведении экскурсий и походов в природу со студентами и школьниками. И, конечно же, большее количество людей затрудняет наблюдение за осторожными, подвижными живот­ными. Каждая экскурсия планируется и готовится заранее. Преподава­тель определяет основную тему предстоящей экскурсии, например: животные леса или луга. При этом он должен иметь в виду, что любая экскурсия будет в той или иной степени комплексной. Например, при экскурсии в смешан­ный лес будут встречены представители классов птиц, млекопита­ющих, земноводных и пресмыкающихся. При подготовке экскурсии преподаватель по карте или плану местности намечает основной маршрут, проходит его заранее, отмечает возможные объекты для наблюдений: следы, погрызы, погадки, гнезда, норы и т.д. Он должен представлять, какие примерно животные (обычные и массовые виды) могут встретиться на экскурсии. Заранее следует подготовить оборудование и одежду. Для наблюдений за птицами и крупными зверями необходим полевой бинокль (не менее 7 – 8-кратного увеличения). Нужно иметь набор оборудования: компас, план местности или под­робную карту, измерительные инструменты (штангенциркуль, линейку, мерную ленту длиной 10 – 20 м). Для сбора следов деятельности животных: по­гадок, старых гнезд и т.д. – необходимо иметь рюкзак и упако­вочную тару – коробки, пакеты и газетную бумагу. Желательно иметь фотоаппарат (видеокаме­ру), портативный магнитофон (диктофон) для записи и воспро­изведения голосов животных. На экскурсиях необходимы полевые оп­ределители птиц (млекопитающих и т.д.) с цветными изображе­ниями животных.

Экскурсия проводится при благоприятной погоде. Не следует проводить экскурсию при обильных осадках, грозе, сильном ветре. Желательно выбрать такое время суток, когда животные наиболее активны и их легче наблюдать.

Экскурсия делится на несколько частей: вводная часть, основ­ная часть и подведение итогов. В начале экскурсии преподаватель делает небольшое введение, знакомит студентов с целью экскурсии, ее продолжительностью, примерным маршрутом. На первой экс­курсии студенты должны познакомиться с географическим по­ложением, рельефом, гидрографией района, почвами, расти­тельностью. Преподаватель обращает внимание студентов на изменение естественных природных ландшафтов в связи с хозяйственной деятельностью людей, напоминает правила поведения на экскурсии, объясняет важность их строгого соблюдения; показывает, как правильно пользоваться биноклем, чтобы быс­тро обнаружить подвижное животное на значительном расстоя­нии, как незаметно подойти к нему, чтобы рассмотреть, услы­шать, зарисовать, сфотографировать. Студенты визуально опре­деляют и записывают в записные книжки состояние погоды: яс­ность солнечного сияния, степень и характер облачности, нали­чие или отсутствие тумана, дымки, осадков, направление и силу ветра. Преподаватель объясняет, как может изменяться поведение животных при разных параметрах среды. После небольшой вступительной беседы группа направляется на экскурсию. Важно соблюдать определенный порядок следования на экс­курсии: преподаватель идет впереди, студенты следуют за ним компактной группой. При обнаружении животного преподава­тель делает знак, чтобы все остановились и обратили внимание на наблюдаемый объект.

На экскурсии преподаватель рассказывает только о том, что удается наблюдать. Результаты экскурсии представляют собой то, что студентам удалось увидеть, услышать, зарисовать, изме­рить (сфотографировать, снять камерой), записать в записную книжку. Преподаватель дает лишь небольшие пояснения наблюда­емым явлениям. Основа экскур­сии – это наблюдения и небольшие самостоятельные работы сту­дентов. Они рассматривают, определяют, измеряют, рисуют схе­мы. Записи делаются краткими, в дальнейшем в лаборатории во время камеральной обработки со­бранного материала студенты расшифровывают полевые записи. Используя специальную литературу, каждый студент состав­ляет дневник полевой практики, в который заносит все со­бранные и обработанные в лаборатории сведения. Нужно тщательно описывать маршрут, природную обста­новку (рельеф, растительность и т.д.), состояние погоды, количество встреченных отдыхающих и т.д. во время каждой экскурсии. Эти описания обычно предваряют все другие экскурсионные наблюдения. Обычно экскурсия продолжается 3 – 4 часа, за это время практиканты проходят 3 – 7 км.

Следует обратить особое внимание на узнавание животных в природе по внешнему облику, го­лосам, следам деятельности. Большую пользу в обучении могут оказать запи­си пения птиц (например, размещенные на сайте http//www.ecosystema.ru). Можно использовать магнитофонные записи го­лосов птиц и во время экскурсий, например, в лесу для подманивания скрытно держащихся видов.

В конце экскурсии подводятся итоги, отмечаются все на­блюдавшиеся виды животных, уточняется фенологический период их жизни, отмечаются редкие, обычные и многочисленные виды.

Работа 4. Методы полевых исследований по зоологии позвоночных

Ознакомьтесь с приведенными в работе сведениями, и, используя литературу, указанную в конце пособия, ответьте на вопросы и выполните задания.

Какое значение имеют методы исследования для учебной полевой практики? Какие основные группы методов полевых исследований принято изучать в рамках учебной практики?

Перечислите основные методы фаунистических исследований.

Какие методы называют прямыми методами изучения животных, а какие – непрямыми?

Что понимают под протоколами наблюдений?

Какие требования предъявляются к записи наблюдений?

Приведите пример содержания самой простой карточки наблюдений.

Назовите основные типы полевых дневников.

В какой программе Windows ведут протоколы наблюдений? Какую информацию содержат таблицы таких дневников?

Какими графическими материалами дополняются экскурсионные записи наблюдений?

Перечислите комплект личного снаряжения и оборудования, включая хирургический инструмент, необходимого для прохождения учебной практики по зоологии позвоночных.

В каком виде сохраняют позвоночных животных для научных и учебных целей?

Ознакомьтесь с дневником Ч. Дарвина во время его путешествия на корабле «Бигль» как образцом работы естествоиспытателя.

Что такое погода? Какие элементы погоды выделяют при ее характеристике? Какие приборы используются для определения температуры, влажности, давления воздуха? Какими приборами определяются скорость, направление и сила ветра?

Какие параметры метеорологических факторов являются оптимальными, а какие критическими для насекомоядных, мышевидных грызунов, куньих-миофагов, куньих-ихтиофагов, копытных?

Как осуществляется движение по азимуту?

Как работают с шагомером и курвиметром?

Какое место занимают географические карты и схемы в зоологической работе? На каких этапах зоологических экскурсий их используют и для каких целей?

Значение методики для успешного проведения экскурсии и исследовательской работы. Успех намеченной экскурсии и исследовательской работы в значительной степени определяется правильно выбранной методикой. Под методикой подразумевается сумма технических приемов, направленных на разрешение той или иной научной проблемы.

Этапы проведения экскурсии и исследования. Экскурсия и исследование осуществляются в несколько этапов – подготовительный, сбор материала в поле, камеральная обработка, обобщение, практическое использование полученных результатов (в частности в курсовой работе или школьном курсе биологии). Последовательность этапов может быть другой, этапы могут повторяться в процессе корректировки исследовательской работы и экскурсии.

Протоколы работы и дневники наблюдений . Запись наблюдений имеет в полевых исследованиях наземных и водных позвоночных исключительно большое значение. Только запротоколированный факт имеет подлинную научную ценность и представляет собой настоящий документ. Запись наблюдений необходимо делать сразу же после наблюдения, ни в коем случае не полагаясь на память (даже при исключительной памяти обилие разнообразных впечатлений может отразиться на точности и достоверности отсроченной фиксации увиденного). При этом можно вести запись сначала на диктофон, затем переносить ее на цифровые или бумажные носители. В записях нужно разграничивать твердо установленные факты от догадок, предположений и сведений, собранных путем опроса других лиц.

Существует несколько способов записи наблюдений, но независимо от того, какой из них используется, необходимо соблюдать некоторые общие правила:

производить записи немедленно или вскоре после наблюдения;

запись наблюдения делать с предельной точностью и ясностью;

всегда указывать дату, время, место и условия наблюдения;

запись делать разборчиво, по возможности без сокращений; если используются сокращения, то они расшифровываются сразу по возвращении с экскурсии.

Тщательное, аккуратное оформление записей чрезвычайно облегчает их последующую обработку. В качестве полевого дневника удобно использовать записные книжки с плотной бумагой, в твердом переплете, формата приблизительно 8 × 11 см. При таком размере дневник свободно помещается в кармане полевой куртки. Записи делаются мягким (2М, В, НВ) простым карандашом или шариковой ручкой, желательно на одной стороне листа. Дневники нумеруются, и на первой странице делается надпись, указывающая период наблюдений, фамилию автора и его адрес с просьбой о возвращении в случае потери.

Наиболее распространенным видом дневника является хронологический дневник. Его часто называют дневником первичных записей . В нем наблюдения протоколируются ежедневно и по порядку. В начале записи указывается число и день недели, затем дается краткая характеристика погоды, далее – экскурсионный маршрут за день и, наконец, следует подробное изложение произведенных наблюдений. Такой дневник имеет те преимущества, что в нем детально фиксируются ход и условия работы, точно отражается последовательность развития сезонных явлений, что позволяет сформировать ясное представление об общих закономерностях в природе в разные годы. А сама техника записей в этом случае максимально простая. Серьезным недостатком хронологических дневников является сложность выборки данных по отдельным видам, местообитаниям и другим вопросам.

Другой вид дневников – предметный , или тематический . Он часто напоминает лабораторный журнал, его страницы обычно имеют вид таблиц, в которые вносятся данные. Нередко дневник заменяется карточками разного формата. В них или в дневниках фиксируются сведения по каждому виду или вопросу последовательно, по мере накопления, в заранее продуманной и подготовленной форме. Содержание и форма самой простой карточки или таблицы представлены ниже.

Фиксация записей в виде таблиц, особенно в приложении Microsoft Office Excel, позволяет обрабатывать данные по видам, биотопам, сезонам, времени суток и т.д. Заполнять такие карточки или таблицы желательно сразу после экскурсии.

Делая первичные записи в полевом дневнике, желательно записывать не только целевые наблюдения (наблюдения объекта исследования), но и другие натуралистические факты, которые в последующем анализе материалов наблюдений позволят сделать более точные оценки и выводы. Как образец работы можно рекомендовать дневник Ч. Дарвина во время его путешествия на «Бигле» (Дарвин, 1935).

Современное полевое зоолого-экологическое исследование должно дополняться графическим материалом – картосхемами, рисунками, фотографиями, а также аудио- и видеозаписями.

Карта или план местности необходимы для полевой работы как в период подготовки, когда происходит предварительное заочное ознакомление с районом и намечаются основные участки и маршруты, так и во время работы в поле. Поэтому следует заранее обеспечить себя как можно более подробными и точными картами и планами или расшифрованными планшетами аэрофото- и космической съемки. В северных лесных районах можно использовать планы леспромхозов с нанесенной на них квартальной сетью, сильно облегчающей не только ориентировку на местности, но и нанесение на карту нужных зоологу данных. Часто кварталы имеют стороны всего в 1 км, а в пределах квартала на плане могут быть обозначены так называемые «выделы», т.е. отдельные участки леса или других угодий. Такие подробные планы представляют исключительную ценность и удобство.

Полезный планово-картографический материал можно получить в местных органах управления, охотничьих хозяйствах, а также у геологов, почвоведов и у геоботаников. Геоботанические карты и планы заслуживают наибольшего внимания в силу исключительного значения растительных сообществ для жизни животных. Карты растительности дают исходный материал для последующей зоолого-экологической оценки. Карты и схемы используются для ориентирования на местности, для нанесения на них маршрутов, учетных линий, пробных площадок и т.д., а также для биосъемки, т.е. для нанесения на нее различных специальных зоологических данных – распространения наиболее важных видов животных, мест их массового скопления, зимовок, путей миграций и кочевок, плотности населения, численности, местонахождения нор, гнезд, колоний, солонцов, водопоев, распределения кормовых ресурсов, изохрон фенологических явлений и т.п.

Если возникает необходимость картирования отдельных небольших участков, почему-либо особенно важных для работы – водоемов, заселенных ондатрой, выхухолью или водоплавающими птицами, колоний, нор или гнезд, то необходимо познакомиться с методикой глазомерной съемки хотя бы в кратком изложении (Новиков, 1949) и включить в научное снаряжение необходимое для нее оборудование: планшет, компас, трехгранную линейку, миллиметровую бумагу, желательно шагомер.

Научная зарисовка . Зоолог должен овладеть минимумом технических приемов рисования, достаточных для изображения необходимой информации. Образцом по использованию техники рисунков являются работы А.Н. Формозова (рис. 1). Рисунок должен схематично, но точно передавать форму и относительные размеры объекта. Обычно необходимо обозначить масштаб или размеры объекта. При зарисовке гнезд важно показать схему расположения их в ветвях.

Рис. 1. След правой передней лапы лисицы, выполненный штриховым и контурным рисунками (по: Формозов, 1989)

Фотографирование . Фотоаппарат прочно вошел в основной арсенал зоолога. Развитие цифровой техники создало основу для еще более широкого применения фотографии в научной работе. Снимок, правильно этикетированный, является не простой иллюстрацией, а таким же научным документом, как запись в дневнике, карта или коллекционный экземпляр. Иногда фотография, например фотография местообитания животного, может заменить длинное описание и дать при этом более ясное представление того, о чем идет речь. Биологические снимки необходимо снабжать какими-либо масштабами для оценки размеров объектов: положить около следа линейку, разместить рядом спичечный коробок, футляр для очков и пр. Без масштаба фотография теряет значительную часть информации. Для съемки животных в природе можно применять некоторые охотничьи приемы – скрадывание, подманивание на голос, засады. Хорошие результаты дает использование скрадка. Если позволяют средства, можно использовать фотоловушки – стационарно установленные фотокамеры с тепловизорами и электромагнитным спуском. Развитие навыков съемки животных следует начинать с домашних животных.

Экскурсионное и экспедиционное оборудование. Успех полевой работы в значительной мере определяется обеспеченностью необходимым оборудованием и снаряжением, о котором в деталях можно прочитать в различных монографиях (см., напр.: Сабанеев, 2004).

Общие естественнонаучные методы полевой работы. Часто необходимые данные по микроклимату гнезд или нор, по защитным условиям различных местообитаний, параметрам среды обитания (например, почвенным), по состоянию кормовых ресурсов и т.д. получают, используя многочисленные приемы и методы, детально описанные Г.А. Новиковым (1949).

Общие зоологические методы полевой работы обычно подразделяют на:

методы фаунистических исследований, позволяющие установить видовой состав животных, обитающих на интересующей территории;

методы количественной оценки популяций;

методы изучения размножения позвоночных животных;

методы изучения питания животных;

методы изучения и регистрации активности животных;

методы изучения сезонных перемещений животных, в частности – миграций птиц (Новиков, 1949). Все эти группы методов имеют специфические особенности при изучении представителей разных классов позвоночных животных – круглоротых, костных рыб, земноводных, пресмыкающихся, птиц и млекопитающих. В рамках практики по зоологии позвоночных ознакомление с основными методами осуществляется на более доступных для наблюдений видах.

Следует заметить, что применяемые в настоящее время методы количественного учета всех позвоночных животных обычно разделяют на две группы. Первая группа включает методы, при использовании которых определяется или общая (тотальная) численность популяции какого-либо вида (например, в результате полного пересчета зверей на морских лежбищах), или плотность населения вида – количество особей на единицу площади учета (например, в результате полного вылова зверьков на пробных площадках). Их называют методами абсолютных учетов численности. Вто­рая группа объединяет методы, которые позволяют определить относительное обилие (относительную численность) вида – количество особей на какую-либо условную единицу измерения: расстояние, время, число встреч за экскурсию или другие показатели. Например, часто подсчитывают число птиц на один километр маршрута, за один час экскурсии или наблюдений на одной точке, про­цент числа встреч конкретного вида от общего числа встреч всех видов за определенное время либо на определенном рас­стоянии. Методы относительного учета обычно используют при изучении фауны для получения сведений о биотопических пред­почтениях отдельных видов или групп видов. Они также делятся на две группы. Первая группа включает способы относительного косвен­ного учета, вторая группа – способы относительного прямого учета. Например, к группе способов относительного косвенного учетаотносится оценка численности зверьков по биологическим индикато­рам. В связи с тем, что хищные птицы-миофаги изменяют районы обитания в за­висимости от обилия (численности) служащих им пищей мел­ких млекопитающих, эти птицы могут быть использованы в ка­честве индикатора заселенности угодий мелкими зверьками (Формозов, 1989).Кгруппе способов относительно прямого учета относится метод учета земноводных и мышевидных грызунов направляющими заборчиками с ловчими конусами.

Основными методами, используемыми для установления видового состава фауны, являются прямые наблюдени я и определения животных в природе . Наблюдать диких животных не всегда легко, так как многие из них скрытные и осторожные или ведут ночной образ жизни. Для наблюдения за дикими животными часто достаточно бинокля и обычного полевого снаряжения (фотоаппарата, записной книжки и пр.). Нередко приходится прибегать и к специальной технике и приборам.

Наблюдения за дикими животными проводятся или на экскурсиях, или путем подкарауливания, сидя на одном месте. Экскурсии могут быть обзорными и целевыми (тематическими). В первом случае экскурсия ведется по какому-либо маршруту и материал собирается подряд, но обычно каждая вылазка имеет свою цель, то более, то менее широкую, но всегда вытекающую из общего плана и программы исследования. Такими экскурсиями могут быть экскурсии для изучения видового состава отдельных биотопов, для наблюдения суточного цикла, сбора материала по питанию и т.п.

Если вы заметили зверя или птицу, то лучше в первый момент не останавливаться, а идти дальше, делая вид, словно не заметили животное. В этом случае оно не так пугается. При скрадывании животного самое важное не делать никаких резких движений, продвигаться постепенно, пользуясь моментами, когда животное чем-нибудь занято, и двигаться не прямо на него, а стороной. При скрадывании зверей нужно внимательно следить за направлением ветра, ибо млекопитающие руководствуются преимущественно обонянием, а затем уже слухом.

Подкарауливание. При умелом выборе места и времени наблюдения подкарауливание позволяет познакомиться с самыми сокровенными сторонами жизни диких животных и получить интереснейшие данные об их экологии и поведении. Особенно полезно устраивать засады около гнезд, нор, на местах кормежки, около водопоев и купалок, у солонцов, на берегах озер и рек, где боровая дичь собирает гальку, на тропах, путях переходов, перелетов или на местах остановок во время миграций. Как экскурсии, так и подкарауливание лучше всего проводить ранним утром или вечером.

Подкарауливание дает еще большие результаты, если применять подманивание животных на пищу, голос и т.д.

Коллектирование собранного материала. Отлов животных, их препарирование и обработка для длительного хранения, сбор продуктов жизнедеятельности животных и их хранение – непременные процедуры, сопровождающие зоологические исследования. Коллектирование животных, принадлежащих к разным классам позвоночных животных, имеет свои особенности и детально описывается в специальных руководствах. В рамках общей практики по зоологии предусматривается ознакомление с некоторыми приемами и методами отлова, препарирования и длительного хранения только амфибий и мелких млекопитающих. Для препарирования животных и снятия необходимых промеров требуются следующие инструменты и материалы (рис. 2): весы с разновесами, линейка, складной метр или рулетка, штангенциркуль, нож-

Рис. 2. Некоторые инструменты для препарирования животных: штангенциркуль, плоскогубцы, острогубцы, скальпели, ножницы, пинцет

ницы, скальпели, пинцеты, скребки для чистки черепов, плоскогубцы или круглогубцы, напильник, мелкозернистый брусок, иголки и нитки, ватман, бумага оберточная, иголки английские, вата и пакля, крахмал (мука картофельная), соль бария или мышьяковистый натр, кисти волосяные, нафталин или другие инсектициды, марля, несессер или футляр для хранения препаровальных инструментов.

Работа 5. Ознакомление с районом проведения практики по зоологии позвоночных

Ознакомьтесь с приказом ректора ЧГУ о прохождении практики студентами, обучающимися по специальности 050102 «Биология» в 2009/10 учеб. г. Используя картографические материалы кафедры биологии ЧГУ, подготовьте индивидуальные карто-схемы района или районов прохождения практики.

РД-АПК 3.10.07.02-09

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Москва 2009

Разработаны: канд. с.-х. наук, ст. науч. сотр. П.Н. Виноградовым, канд. техн. наук С.С. Шевченко, О.Л. Седовым, Е.С. Гарафутдиновой, М.Ф. Малыгиным (НПЦ «Гипронисельхоз»); д-р вет. наук, проф. В.Г. Тюриным (ГНУ ВНИИВСГЭ)

ВНЕСЕНЫ: НПЦ «Гипронисельхоз».

УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ: заместителем Министра сельского хозяйства Российской Федерации А.И. Беляевым 1 декабря 2009 г.

РАЗРАБОТАНЫ ВПЕРВЫЕ.

Дата введения 15.12.2009

1 Общие положения

1.1. Настоящие методические рекомендации распространяются на все научно-исследовательские организации и учебные заведения АПК России независимо от их организационно-правовой формы, использующие в своей работе лабораторных (экспериментальных, подопытных) животных.

В соответствии с Федеральным законом «О техническом регулировании » (принят Государственной Думой 15 декабря 2002 г. и одобрен Советом Федерации 18 декабря 2002 г.) до принятия соответствующих регламентов техническое регулирование в области принятия ветеринарно-санитарных мер осуществляется в соответствии с Законом Российской Федерации «О ветеринарии» (утвержден 14 мая 1993 г., № 4979-1).

1.2. Методические рекомендации распространяются как на вновь проектируемые объекты для содержания и работы с лабораторными животными - экспериментально-биологические клиники, виварии и др., так и на действующие и реконструируемые.

1.3. Объекты для содержания и работы с лабораторными животными являются научно-вспомогательными подразделениями научно-исследовательских организаций, учебных заведений и создаются для содержания и при необходимости для разведения лабораторных животных, используемых в экспериментальных работах и исследованиях. На этих объектах может проводиться также и самостоятельная разработка отдельных научных вопросов.

1.4. Изложенные в данных методических рекомендациях нормативы и требования по проектированию, строительству и эксплуатации объектов для содержания лабораторных животных направлены на обеспечение безопасности работающего с животными персонала и населения в целом от возникновения антропозаонозов и других заболеваний.

1.5. Разработка, согласование, утверждение и состав проектной документации на строительство объектов для содержания лабораторных животных осуществляются в соответствии с требованиями СНиП 11.01-2003 .

1.6. Объект для содержания лабораторных животных (далее виварий) размещается в отдельно стоящем здании (комплексе зданий) или на верхних этажах лабораторных корпусов ветеринарных государственных научных учреждений, а также на территории учебных заведений.

1.7. Виварии должны быть обеспечены водой питьевого качества, в том числе горячей, электроэнергией, оборудованы канализацией (трубы диаметром не менее 100 мм), приточной и вытяжной вентиляцией, отоплением, охранной и пожарной сигнализацией, иметь удобные подъездные пути.

1.8. Расстояние между отдельно стоящим зданием вивария и сооружениями научно-исследовательских учреждений, в состав которых входит настоящий виварий, должно быть не менее расстояния противопожарных разрывов, установленных действующими правилами пожарной безопасности в Российской Федерации.

1.9. Отдельно стоящие здания вивариев должны быть огорожены глухим забором и отделены от жилого массива санитарно-защитной зоной. Территория должна быть озеленена.

Размеры санитарно-защитной зоны определяются требованиями СаНПиН 2.2.1/2.1.1.1200-03 .

1.10. Размеры санитарно-защитной зоны для вивариев, расположенных в отдельно стоящих административных, производственных зданиях и имеющих изолированный выход, согласовываются в каждом конкретном случае с органами государственного санитарного и ветеринарного надзора.

2. Состав, взаиморасположение и нормы площади помещений вивариев

2.1. В состав каждого вивария должны быть включены помещения, запроектированные в соответствии с действующими строительными нормами и правилами с соблюдением действующих ветеринарно-санитарных требований и зоогигиенических нормативов, в том числе:

комната обслуживающего персонала с индивидуальными шкафчиками для спецодежды;

помещения для приема и карантинирования вновь поступающих в виварий животных;

изолятор;

помещения для содержания подопытных животных (отдельные для каждого вида) или (по согласованию с органами государственного ветеринарного и санитарного надзора) разделенные на секции по видам животных;

стерилизационная или бокс для работы исследователей с незараженными животными, с помещением для вскрытия животных и холодильником для временного хранения трупов;

изолированные помещения для содержания подопытных животных, зараженных культурами возбудителей особо опасных инфекций или радиоактивными веществами (раздельно) с операционной при каждом изолированном помещении, имеющей холодильник и необходимое оборудование для заражения и вскрытия животных;

кормокухня для приготовления кормов (должна быть оборудована плитой и холодильником);

дезинфекционно-моечное отделение для мойки горячей водой, дезинфекции и сушки клеток и другого инвентаря;

склад чистого (обеззараженного) запасного инвентаря: клеток, поилок и др.;

санитарный блок (душевая и туалет);

помещение, оборудованное печью для сжигания трупов животных;

общая холодильная камера для хранения трупов животных;

склад кормов;

склад подстилки;

в отдельном помещении или в отдельно расположенном здании - технический узел для кондиционеров, вентиляционных, электротехнических и других специальных установок.

2.2. В каждом виварии должно быть помещение для приема поступающих животных. В вивариях, в которых содержат мелких грызунов, перед приемным отделением устанавливается утепленный тамбур, в который въезжает и разгружается машина с прибывшими животными.

При размещении вивария на верхних этажах лабораторных корпусов приемное отделение и утепленный тамбур располагаются на первом этаже лабораторного корпуса и связываются с виварием лифтом, используемым только для подъема лабораторных животных.

2.3. Помещение приема представляет собой комнату площадью 12,5 - 18 м 2 с естественным и искусственным освещением в соответствии с требованиями .

Высота всех помещений вивария составляет 3 - 3,5 м.

2.4. Помещение карантина состоит из нескольких изолированных комнат площадью 12,5 - 18 м 2 и изолируется от помещений, в которых содержатся животные, прошедшие карантин и поступающие для проведения экспериментов.

2.5. К помещениям карантина примыкает помещение изолятора для больных животных и животных с подозрением на заболевания. Площади комнат изолятора аналогичны площадям комнат для карантина.

2.6. Помещения, предназначенные для содержания подопытных животных, могут выходить в один общий коридор или располагаться между двумя коридорами и иметь выходы в каждый из них. При однокоридорной планировке «грязные» и «чистые» службы располагают в разных концах коридора.

При двухкоридорной системе по одному коридору («чистому») поступают корма, прошедшие карантин животные, входят перед началом работы с животными сотрудники в чистой спецодежде и сменной обуви. По другому («грязному») коридору удаляют несъеденные корма и навоз, выносят трупы животных, выходят сотрудники после работы с животными.

При невозможности изоляции «грязных» и «чистых» потоков допускается использование одного и того же помещения для той или другой цели при условии, что оно будет дезинфицироваться каждый раз после прохождения по нему «грязного» потока.

2.7. Площадь помещений для содержания отдельных видов подопытных животных составляет 12,5 - 18 м 2 ; площадь помещения для содержания подопытных животных, разделенная на секции, определяется расчетом.

2.8. Площадь стерилизационной или бокса для работы исследователей с незараженными животными определяется расчетом, исходя из специфики предполагаемой работы.

2.9. Площади изолированных помещений для работы с подопытными животными, зараженными возбудителями особо опасных инфекций, и для работы с подопытными животными, зараженными радиоактивными веществами, а также площади операционных при каждом изолированном помещении определяются расчетом, исходя из условий применяемого технологического и специального оборудования для проведения необходимых манипуляций.

2.10. Общая площадь помещений, занимаемая кормокухней, дезинфекционно-моечным отделением и складом чистого запасного инвентаря, должна составлять примерно 50 % от общей площади помещений, занятых животными (в крупных вивариях этот процент может быть несколько уменьшен).

Кормокухня состоит из двух смежных помещений, предназначенных для переработки и приготовления кормов. Каждое помещение должно иметь выход в коридор.

Дезинфекционно-моечное отделение (одно или несколько) состоит из двух комнат, соединенных проходным автоклавом или проходной сухожаровой камерой.

Устройство дезинфекционно-моечного отделения должно предусматривать различную последовательность его работы:

при наличии инфицированного материала - предварительную стерилизацию инвентаря и подстилки с дальнейшей механической очисткой последнего в другом помещении;

стерилизацию после механической очистки клеток и инвентаря, когда нет опасности наличия зараженного материала.

Независимо от размещения вивария (в отдельно стоящем здании или на верхнем этаже лабораторного корпуса) в дезинфекционно-моечном отделении следует предусматривать мусоропровод для удаления грязной подстилки и механизированный подъем материалов и оборудования.

Склад чистого инвентаря и оборудования размещается рядом с дезинфекционно-моечным отделением.

2.11. Для хранения подстилки (стружки, опилки, торф и др.) выделяются два помещения: одно для простерилизованной и упакованной в используемую данным виварием тару, другое - для хранения вновь приобретенной подстилки.

2.12. При проектировании помещений вивария необходимо обеспечить максимальную изоляцию:

всех его помещений от остальных подразделений, входящих в состав научно-исследовательского учреждения;

помещений изолятора и карантина от остальных помещений вивария;

между кормокухней, помещениями для животных и дезинфекционно-моечным отделением.

2.13. В каждом конкретном случае площадь, занимаемая кормокухней, дезинфекционно-моечным отделением и складом чистого запасного инвентаря, устанавливается в зависимости от применяемого оборудования, степени механизации производственных процессов и видов корма для подопытных животных.

Размеры площадей вышеперечисленных помещений указываются в задании на проектирование.

3. Ветеринарно-санитарные и технологические требования к строительным решениям помещений вивария и инженерному оборудованию

Светильники и осветительная арматура закрытого типа должны быть доступны для влажной очистки.

3.5. Помещения вивария, в которых содержатся лабораторные животные, оборудуются принудительной приточно-вытяжной системой вентиляции, обеспечивающей кратность воздухообмена и температурно-влажностный режим в соответствии с данными, приведенными в табл. .

3.6. Температурно-влажностный режим в других помещениях вивария должен обеспечиваться в соответствии с данными, приведенными в табл. .

СНиП 11.01-2003. Инструкция о порядке разработки, согласования, утверждения и состава проектной документации на строительство предприятий, зданий и сооружений.

. СаНПиН 2.2.1/2.1.1.1200-03 . Санитарно-защитные зоны и санитарная классификация предприятий, сооружений и других объектов (Новая редакция. Утверждена постановлением Главного санитарного врача РФ № 74 от 25.09.07, зарегистрирована Министерством юстиции РФ № 10995 от 25.01.08).

Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества.

Тема 4. Использование лабораторных животных в диагностических исследованиях. Цели использования лабораторных животных в вирусологии

Задание к следующему занятию

Подведение итогов занятия

Задания

1. Найти под световым микроскопом в препаратах и зарисовать:

а) цитоплазматические тельца-включения;

б) внутриядерные тельца-включения;

в) вирионы вируса оспы в окраске по Морозову.

2. Ознакомиться с устройством и принципом работы электронного микроскопа.

3. Дешифрировать электронные микрофотографии вирионов разных вирусов (дать их схематический рисунок).

Самостоятельная работа студентов

Студенты знакомятся с устройством светового, люминесцентного и электронного микроскопов (в лаборатории), зарисовывают схему строения электронного микроскопа. Знакомятся с подготовкой препаратов для электронной микроскопии. Просматривают готовый препарат в люминесцентном микроскопе. Зарисовывают схему прямого и непрямого метода РИФ.

Контрольные вопросы:

1. Устройство электронного микроскопа.

2. Методы подготовки препаратов для просмотра в электронном микроскопе.

3. Люминесцентную микроскопию (РИФ) прямой и непрямой методы.

4. Значение электронной и люминесцентной микроскопии в вирусологических исследованиях.

Цель занятия: ознакомить студентов с требованиями к видам лабораторных животных, их карантинированием, содержанием, кормлением, мечением.

Оборудование и материалы: набор инструментов в стерилизаторе (ножницы, иглы, шприцы, пинцеты, корнцанги), лабораторные животные, ватные спиртовые тампоны краски для мечения, эфир, ксилол, мультимедийное оборудование, плакаты и презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Объяснение преподавателя: Большинство вирусов разных таксономических групп могут быть отличимы друг от друга на основе патогенности для лабораторных животных разных видов или возраста.

4.1 Виды лабораторных животных. Наиболее широко в вирусологических лабораториях применяют мышей, бе­лых крыс, кроликов, морских свинок, хомяков, цыплят. У молодых мышей экс­периментально воспроизводят грипп, альфа- и флавивирусные инфекции, ящур (на новорожденных мышатах) и др. Они восприимчивы ко многим вирусам, их легко разводить и с ними удобно работать. Лучше использовать мышей инбредных линий, так как они почти одинаково реагируют на тот или иной вирус. У крыс также создают инбредные линии, но эти животные более устойчивы к оп­ределенным вирусным инфекциям, чем мыши. Онкогенность некоторых виру­сов широко изучают на золотистых хомячках. Для вирусологических опытов обычно используют гладкошерстных морских свинок массой 250–300 г.

Ту или иную инфекцию иногда изучают на животных нескольких видов, об­ладающих разной чувствительностью к данному вирусу, что позволяет диффе­ренцировать вирусы, вызывающие клинически сходные симптомы болезни (на­пример, ящур, везикулярный стоматит, везикулярная экзантема и везикулярная болезнь свиней).

По генетическим качествам лабораторных животных делят на четыре группы:

1) животные смешанного происхождения, полученные от разных животноводов, такие животные гетерогенны;

2) животные, полученные непосредственно из од­ного источника, однако генетически такие животные вариабельны;

3) инбредные линии животных. Их получают в результате спаривания брата с сестрой или родителей с детьми по крайней мере не менее 20 поколений. При таком методе разведения достигается все возрастающая степень гомозиготности.

4) однородные гибриды F 1 . Высокая степень гетерозиготности, характерная для каждого гибрида, связана здесь с генетическим однообразием, которое соответствует степени гомозиготности родительских линий. Как правило, однородные гибриды F 1 менее изменчивы, чем обе родительские ли­нии. Животные-мутанты имеют отдельно выраженный наследственный фактор, который обусловливает видимое отклонение от нормальной формы.

Отрицательная сторона выделения вируса на лабораторных животных – воз­можность диагностических ошибок вследствие активации скрытого вирусоносительства. В этом случае развитие симптомов болезни после введения матери­ала не следствие действия введенного вируса, а результат самой процедуры, на­рушающей предшествующее равновесие в организме. В это время проявляется вирус или другой инфекционный агент, длительно персистирующий в организ­ме. Выражается это резкими неврологическими симптомами (повороты вдоль длинной оси тела).

Наличие скрытой вирусной инфекции может также выражаться уменьшени­ем или исчезновением чувствительности животных к исследуемому вирусу вслед­ствие явления интерференции. Возможен и противоположный эффект, а имен­но – явление синергизма в действии вирусов, что дает иногда результаты, труд­ные для правильной интерпретации.

Для некоторых вирусологических работ, например при выделении вируса с невыясненными болезнетворными свойствами, необходимо использовать гнотобиотов. Термин «гнотобиоты» объединяет две категории животных: безмик­робных (стерильных), не содержащих никаких жизнеспособных микробов, и гнотофор – носителей одного (моногнотофоры), двух (дигнотофоры) или более (полигнотофоры) микроорганизмов. В настоящее время безмикробные животные по динамике роста делятся на три группы: I – обезьяны, поросята, цыплята растут лучше обычных животных или наравне с ними; II – крысы, мыши, собаки, кошки растут наравне с обычными животными; III – морские свинки, кролики, козлята, ягнята растут хуже обычных животных.

Стерильных птиц получают посредством инкубации яиц со стерильной скор­лупой в стерильном инкубаторе, лабораторных животных – путем кесарева се­чения или гистерэктомии. Содержат животных в стерильных изоляторах. Воз­дух, вода и корм должны быть стерильными.

Особое значение среди гнотобиотов занимают СПФ-животные (Specific pathogen free), которые свободны только от патогенных микроорганизмов. В их организме имеются все необходимые для нормальной жизнедеятельности бактерии и ви­русы, которые в совокупности создают группу так называемой резидентной (по­лезной) микрофлоры. В настоящее время получены лабораторные СПФ-живот­ные – крысы, морские свинки, кролики, поросята, птицы и др.

4.2 Цели использования лабораторных животных. В настоящее время лабораторных животных используют в вирусологии для:

– обнаружения вируса в патматериале;

– первичного выделения вируса из патматериала;

– накопления вирусной массы;

– поддержания вируса в лаборатории в активном состоянии;

– титрования вируса;

– получения гипериммунных сывороток;

– в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации.

В вирусологии используют кроликов, морских свинок, белых крыс, белых мышей, золотистых хомячков. Однако только некоторые вирусы удается культивировать на животных перечисленных видов. Во многих случаях для тех же целей используют других чувствительных к данному вирусу животных: кур, голубей, котят, щенков и т. д. Так, биопробу при диагностике оспы птиц ставят на курах, оспы овец – на овцах, чумы свиней – на подсвинках.

4.3 Требования к лабораторным животным. Комплектуя группы животных для вирусологических исследований, необходимо выполнять следующие требования:

– животное должно быть чувствительным к данному вирусу;

– возраст его имеет большое значение для культивирования многих вирусов. Большинство вирусов лучше размножается в организме молодых и даже новорожденных животных. Например, для биопробы на бешенство и ящур используют мышей-сосунов, на ларинготрахеит птиц – цыплят. Но в то же время заражение взрослых кроликов вирусом болезни Ауески ведет к появлению ярких и специфичных клинических признаков заболевания;

– стандартная чувствительность достигается подбором животных определенного возраста и одинаковых по массе;

– лабораторные животные должны быть здоровы. Животные, поступающие в виварий вирусологической лаборатории, должны быть привезены из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Их содержат изолированно, т. е. в карантине (белых мышей и крыс 14 дней, а остальных животных 21 день). В этот период за животными ведут ежедневное клиническое наблюдение. При подозрении на наличие инфекционной болезни животных подвергают лабораторному исследованию. В случае установления инфекционного заболевания среди животных всю поступившую партию уничтожают.

4.4 Содержание лабораторных животных. Виварий для лабораторных животных должен иметь основное помещение для животных, моечную (с боксом, сушиль­ными и стерилизационными установками), кухню для приготовления корма с одним по крайней мере столом, оборудованным для приготовления корма, и холодильником для скоропортящихся продуктов, кладовую, операционную, гар­дероб и санитарное помещение для обслуживающего персонала. Помещения должны быть чистыми. Стены и полы легко дезинфицируемыми. Запасы корма следует хранить в специальных помещениях. В местах содержания опытных животных желательно иметь гигрометр и термометр.

Мышей, крыс, хомяков и морских свинок в период опыта рекомендуется содержать в стеклянных банках с крышкой из проволочной сетки или перфори­рованного листового железа. Это облегчает наблюдение за ними, а банки легко чистить и дезинфицировать. Можно содержать животных в металлических клет­ках, которые также легко дезинфицировать.

В качестве подстилки применяют материалы, которые адсорбируют влагу и могут быть использованы животными для постройки гнезда: стружку для мы­шей, крыс, хомяков, морских свинок, хорьков, кур; опилки для крупных мы­шей, крыс, хомяков, хорьков, кур; солому для хомяков, морских свинок, кроли­ков, собак, кур; мякину для мышей, крыс; сено для мышей, крыс, хомяков, хорьков, кур; песок для кур. Следует использовать такую подстилку, которая образует как можно меньше пыли, так как последняя может привести к заболева­нию органов дыхания. Любую подстилку необходимо предварительно стерили­зовать при 100 °С в течение 30 мин.

Помещения для лабораторных животных периодически дезинфицируют, осо­бенно перед размещением новой партии животных. Это относится и к предме­там ухода за животными (лопаты, скребки, метелки и др.), которые соприкаса­ются с навозом и различными отбросами из помещения. После окончания каж­дого опыта клетки обязательно обрабатывают дезинфицирующими растворами, чему должна предшествовать чистка как клеток, так и помещения.

Посуду для корма и воды ежедневно смачивают дезинфицирующим раствором, после чего моют и споласкивают чистой водой. Помещения обрабатывают 1% раствором едкого натра, который используют в течение суток. Дезковрики пропитывают свежим раствором каждые 2 дня. Для дезинфекции предме­тов ухода, мытья полов и посуды рекомендуется использовать 3% раствор хлорамина, который должен быть применен в течение 2 ч. В виварии необходи­мо уничтожать вредителей: мух, комаров, блох, власоедов, клещей, вшей, му­равьев, мышей, крыс.

Лабораторных животных размещают так, чтобы, с одной стороны, было обеспечено функционирование всех систем организма в пределах физиологической нормы, с другой – исключено взаимное перезаражение и распространение инфекции за пределы вивария. Животных содержат в виварии с учетом их физиологической потребности в освещенности и температуре. Так, мышам, крысам нужны полумрак и температура воздуха около 20 °С, морским свинкам, кроликам и курам – дневной свет и температура в пределах 16–23, 14–18 и не ниже 0°С соответственно. Плотность посадки должна составлять примерно 1 г массы лабораторных животных на 1 см 2 дна клетки. Животных обеспечивают регулярным и полноценным кормлением и постоянно питьевой водой.

Если виварий один, зараженных животных содержат изолированно от здоровых и с последних начинают уборку помещения и кормление. Для ухода за зараженными животными используют отдельный инвентарь и кормушки. Лучше иметь два вивария: для содержания здоровых и зараженных животных.

Обслуживающий персонал при работе в виварии пользуется спецодеждой: халатом, резиновыми перчатками, фартуком, непромокаемой обувью. В виварии ежедневно дезинфицируют инвентарь и проводят влажную уборку с применением дезинфицирующих веществ. По окончании эксперимента клетки дезинфицируют, погибших животных обезвреживают сжиганием в печах или автоклавированием.

В группу для проведения опыта подбирают животных с одинаковыми показа­телями массы, температуры, состава крови и т. д. От этого в значительной степени зависит успех выделения, титрования и пассирования вируса. При этом учитывают восприимчивость животных к различным вирусам. Отобранных животных метят, распределяют по банкам или клеткам, отмечают дату постановки опыта, его номер, заражающую или профилактическую дозу препарата и, если необходимо, как мечены животные. Последнее важно, когда в одной банке или клетке находятся животные нескольких групп.

Таблица 1

Масса животных в разном возрасте