Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Исследуемый материал и основные этапы анализа

Исследование бактерий имеет большое практическое значение для человека. На сегодняшний день открыто большое количество прокариот, которые отличаются друг от друга по патогенности, области распространения, форме, размерам, количеству жгутиков и другим параметрам. Чтобы детально изучить данный штамм, применяется бактериологический метод исследования.

Какие существуют методы клеток?

Чтобы определить, являются ли бактерии патогенными, проводят исследование культуры различными способами. Среди них:

1. Бактериоскопический метод.

2. Бактериологический метод.

3. Биологический метод.

Бактериоскопический и бактериологический основаны непосредственно на работе с клетками прокариот, когда биологический анализ требуется для изучения влияния таких клеток на живой организм подопытных животных. По степени проявления тех или иных признаков заболевания ученый может сделать вывод о наличии или отсутствии патогенных бактерий в пробе, а также естественно их размножить в организме животного для получения их культуры и использования в других работах.

Бактериологический метод исследования отличается от бактериоскопического. В первом для анализа используется специально подготовленная культура живых прокариот, когда во втором проводится работа с мертвыми или живыми клетками на предметном стекле.

Этапы бактериологического метода исследования. Микробиология

Принцип изучения свойств бактериальной культуры может пригодиться как для ученых-микробиологов, которые поставили цель исследовать прокариотические клетки, так и для лаборантов, задача которых заключается в установлении патогенности или непатогенности бактерий, а затем диагноза пациента.

Методика изучения бактерий делится на три этапа:

1. Выделение бактерий из первоначальной пробы.

2. Высевание бактерий и выращивание изучение ее свойств.

Первый этап

Проба, или мазок, берется со свободной поверхности среды или у пациента. Таким образом мы получаем «коктейль» из множества видов бактерий, которые должны высеять на питательную среду. Иногда появляется возможность выделить сразу необходимые бактерии, зная их очаги распространения в организме.

Через двое-трое суток отбираются нужные колонии и высеваются на твердые среды чашек Петри с помочью стерильной петли. Во множестве лабораторий работают с пробирками, где может находиться твердая или жидкая питательная среда. Так и проводится бактериологический метод исследования в микробиологии.

Второй этап

После получения отдельных колоний бактерий проводится непосредственный макро- и микроанализ. Измеряются все параметры колоний, определяется цвет и форма каждой из них. Нередко проводится подсчет колоний на чашке Петри, а затем в исходном материале. Это имеет значение при анализе патогенных бактерий, от числа которых зависит степень заболевания.

Бактериологический метод исследования, 2 этап которого заключается в изучении отдельных колоний микроорганизмов, может быть сопряжен с биологическим способом анализа бактерий. Еще одна цель работы на этом этапе - увеличить количество исходного материала. Это можно сделать на питательной среде, а можно провести эксперимент в естественных условиях на живых подопытных организмах. Патогенные бактерии будут размножаться, и в результате кровь будет содержать миллионы клеток прокариот. Из взятой крови легко приготовить необходимый рабочий материал бактерий.

Третий этап

Самая важная часть исследования - это определение морфологических, биохимических, токсигенных и антигенных свойств культуры бактерий. Работа ведется с заранее «очищенными» культурами на питательной среде, а также с препаратами (зачастую окрашенными) под микроскопом.

Установить принадлежность патогенных или условно-патогенных бактерий к той или иной систематической группе, а также определить их устойчивость к лекарствам позволяет бактериологический метод исследования. 3 этап - антибиотики, т. е. анализ поведения клеток бактерий в условиях содержания лекарственных препаратов в окружающей среде.

Исследование устойчивости культуры к антибиотику имеет важное практическое значение, когда необходимо прописать для конкретного пациента необходимые, а главное, действенные препараты. Здесь и может помочь бактериологический метод исследования.

Что такое питательная среда?

Для развития и размножения бактерии должны находиться в заранее подготовленных питательных средах. По консистенции они могут быть жидкие или твердые, а по происхождению - растительные или животные.

Основные требования к питательным средам:

1. Стерильность.

2. Максимальная прозрачность.

3. Оптимальные показатели кислотности, активности воды и других биологических величин.

Получение изолированных колоний

1. Метод Дригальского. Он заключается в том, что на бактериальную петлю наносится мазок с различными видами микроорганизмов. Этой петлей проводят по первой чашке Петри с питательной средой. Далее, не меняя петлю, методом остаточного материала проводят по второй и третьей чашкам Петри. Так, на последних образцах колонии бактерии будут засеваться не слишком плотно, тем самым упрощается возможность найти необходимые для работы бактерии.

2. Метод Коха. В нем используются пробирки с расплавленной питательной средой. Туда помещается петля или пипетка с мазком бактерий, после чего содержимое пробирки выливается на специальную пластинку. Агар (или желатин) застывает через какое-то время, а в его толще легко обнаружить нужные колонии клеток. Важно перед началом работы развести смесь бактерий в пробирках, чтобы концентрация микроорганизмов не была очень большой.

Этапы которого основаны на выделении нужной культуры бактерий, не обходится без этих двух способов нахождения изолированных колоний.

Антибиотикограмма

Визуально реакцию бактерий на препараты можно заметить двумя практическими способами:

1. Метод бумажных дисков.

2. Разведение бактерий и антибиотика в жидкостной среде.

Метод бумажных дисков требует наличия культуры микроорганизмов, которые были выращены на твердой питательной среде. На такую среду кладут несколько бумажек округлой формы, пропитанных антибиотиками. Если препарат успешно справляется с нейтрализацией бактериальных клеток, после такой обработки останется участок, лишенный колоний. Если же реакция на антибиотик отрицательная, бактерии выживут.

В случае использования жидкой питательной среды сперва готовят несколько пробирок с культурой бактерий разных степеней разведения. В эти пробирки добавляют антибиотики, и в течение суток наблюдают за процессом взаимодействия вещества и микроорганизмов. В конечном итоге получается качественная антибиотикограмма, по которой можно судить об эффективности препарата для данной культуры.

Основные задачи анализа

Здесь перечислены по пунктам цели и этапы бактериологического метода исследования.

1. Получить исходный материал, который будет использоваться для выделения колоний бактерий. Это может быть мазок с поверхности любого предмета, слизистой оболочки или полости органа человека, анализ крови.

2. на твердой питательной среде. Через 24-48 часов на чашке Петри можно обнаружить колонии бактерий разных видов. Отбираем по морфологическим и/или биохимическим критериям нужную и проводим уже с ней дальнейшую работу.

3. Размножение полученной культуры. Бактериологический метод исследования может опираться на механический или биологический способ увеличения численности культуры бактерии. В первом случае ведется работа с твердыми или жидкими питательными средами, на которых в термостате размножаются бактерии и образуют новые колонии. Биологический способ требует естественных условий увеличения численности бактерий, поэтому здесь микроорганизмами заражается подопытное животное. Через несколько суток в пробе крови или мазке можно обнаружить множество прокариот.

4. Работа с очищенной культурой. Чтобы определить систематическое положение бактерий, а также их принадлежность к возбудителям заболеваний, необходимо провести тщательный анализ клеток по морфологическим и биохимическим признакам. При исследовании патогенных групп микроорганизмов важно знать, насколько эффективно действие антибиотиков.

Это была общая характеристика бактериологического метода исследования.

Особенности проведения анализа

Главное правило проведения бактериологического исследования - это максимальная стерильность. Если идет работа с пробирками, посевы и пересевы бактерий должны проводиться только над нагретой спиртовкой.

Все этапы бактериологического метода исследования требуют использования специальной петли или пастеровской пипетки. Оба инструмента должны быть предварительно обработаны в пламени спиртовки. Что касается пастеровской пипетки, то тут перед термической стерилизацией необходимо отломать кончик пипетки пинцетом.

Техника посева бактерий тоже имеет свои особенности. Во-первых, при посеве на твердые среды проводят бактериальной петлей по поверхности агара. Петля, конечно же, уже должна иметь на поверхности образец микроорганизмов. Также практикуется посев внутрь и в этом случае петля или пипетка должны достичь дна чашки Петри.

При работе с жидкими средами используются пробирки. Здесь важно следить, чтобы жидкости не касались краев лабораторной посуды или пробки, а используемые инструменты (пипетка, петля) не дотрагивались до посторонних предметов и поверхностей.

Значение биологического метода исследования

Анализ пробы бактерий имеет свое практическое применение. Прежде всего бактериологический метод исследования может использоваться в медицине. К примеру, необходимо изучить микрофлору больного, чтобы установить правильный диагноз, а также выработать правильный ход лечения. Здесь помогает антибиотикограмма, которая покажет активность лекарственных препаратов против возбудителя заболеваний.

Анализ бактерий используется в лаборатории для определения таких опасных заболеваний, как туберкулез, возвратный тиф или гонорея. Также он применяется для изучения бактериального состава миндалин, полостей органов.

Бактериологический метод исследования можно использовать для определения загрязненности среды. По данным о количественном и качественном составе мазка с поверхности какого-либо предмета определяется степень заселенности данной среды микроорганизмами.

10385 0

Применение бактериологического метода дает возможность выделить возбудителя в чистой культуре из материала, полученного от больного, и идентифицировать его на основании изучения комплекса свойств. Большинство бактерий способны к культивированию на различных искусственных питательных средах (кроме хламидий и риккетсий), поэтому бактериологический метод имеет важное значение в диагностике многих инфекционных болезней.

В случае получения положительного результата бактериологический метод позволяет определить чувствительность выделенного возбудителя к антимикробным препаратам. Однако эффективность указанного исследования зависит от многих параметров, в частности от условий сбора материала и его транспортировки в лабораторию.

К основным требованиям , предъявляемым к отбору и транспортировке материала для бактериологического исследования, относят:

• взятие материала до начала этиотропного лечения;
• соблюдение условий стерильности при сборе материала;
• техническую правильность сбора материала;
• достаточное количество материала;
• обеспечение температурного режима хранения и транспортировки материала;
• сведение к минимальному промежутка времени между сбором материала и посевом на плотные питательные среды.

Транспортировка материала в лабораторию должна быть осуществлена по возможности немедленно, но не более чем в течение 1—2 ч после его взятия. Пробы материала должны находиться при определенном температурном режиме; в частности, стерильные в норме материалы (кровь, спинномозговая жидкость) хранят и доставляют в лабораторию при 37 °С. Нестерильные материалы (моча, отделяемое дыхательных путей и др.) хранят при комнатной температуре не более 1-2 ч или не более суток при 4 °С (условия бытового холодильника). При невозможности доставки проб в лабораторию в регламентированные сроки рекомендуют использовать транспортные среды, предназначенные для сохранения жизнеспособности возбудителей в условиях консервации.

Кровь для исследования следует брать у больного в период подъема температуры тела, в начале появления лихорадки. Рекомендуется исследовать 3-4 пробы крови, взятые с интервалом 4-6 ч, что обоснованно с точки зрения снижения риска «упустить» транзиторную бактериемию и повышения возможности подтвердить этиологическую роль выделенной из крови условно-патогенной микрофлоры, если эта микрофлора обнаруживается в нескольких пробах венозной крови. Пробу крови в количестве 10 мл у взрослого и 5 мл у детей засевают минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10. Желательно однократное исследование и артериальной крови.

Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) производит врач при люмбальной пункции в количестве 1-2 мл в сухую стерильную пробирку. Пробу немедленно доставляют в лабораторию, где к ее исследованию приступают также немедленно. При отсутствии такой возможности материал сохраняется при 37 °С в течение нескольких часов. Существенно повышает количество положительных результатов бактериологического исследования посев 1-2 капель СМЖ в пробирку, содержащую полужидкую среду с глюкозой, и в чашку Петри с «кровяным» агаром. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термосы или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °С.

Испражнения для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3-5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала должно быть начато не позже чем через 2 ч. Если невозможно приступить к исследованию в течение этого времени, следует отобрать небольшое количество материала, который помещают в соответствующую транспортную среду. При отборе испражнений следует стремиться направлять для исследования патологические примеси (слизь, гной, частицы эпителия и др.), если они имеются, избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами.

Для взятия материала могут быть использованы ректальные тампоны (с ватным наконечником). Тампон должен быть увлажнен стерильным изотоническим раствором натрия хлорида или транспортной средой (но не масляным гелем). Его вводят per rectum на глубину 5-6 см и, поворачивая тампон, осторожно его извлекают, контролируя появление на тампоне фекальной окраски. Тампон помещают в сухую пробирку, если к исследованию материала приступят в течение 2 ч, в ином случае - в транспортную среду.

Мочу (средняя порция свободно выпущенной мочи) в количестве 3-5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительней отбирать утренние порции мочи.

Желчь собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики.

Промывные воды желудка собирают в стерильные банки в количестве 20-50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами - лучше кипяченой водой (без добавления соды, перманганата калия и пр.).

Мокрота . Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.

Промывные воды бронхов . При бронхоскопии вводят не более 5 мл изотонического раствора натрия хлорида с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.

Отделяемое глотки, ротовой полости и носа . Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном либо ложечкой со слизистой оболочки и ее пораженных участков у входов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, который осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля. Для проведения анализа на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки, беря материал разными тампонами.

Исследуемый материал засевают на плотные питательные среды, используя специальные методики для получения роста отдельных колоний микроорганизмов, которые далее отсевают с целью выделения чистой культуры возбудителя.

Определенные виды бактерий выделяют, используя элективные (избирательные) среды, которые задерживают рост посторонних микроорганизмов или содержат вещества, стимулирующие рост определенных патогенных микробов.

Выделенные на питательных средах микроорганизмы идентифицируют , т.е. определяют видовую или типовую их принадлежность. В последнее время для идентификации в практике здравоохранения используют микротест-системы, представляющие собой панели с набором дифференциально-диагностических сред, что ускоряет исследование. Микротест-системы применяют и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения антибиотика в жидкой питательной среде.

Оценивая результаты бактериологического исследования, врач должен учитывать, что отрицательный результат не всегда означает отсутствие возбудителя и может быть связан с применением антимикробных препаратов, высокой микроцидной активностью крови, техническими погрешностями. Обнаружение патогенного микроба в материале от больного вне связи с клинической картиной возможно в случае реконвалесцентного, здорового или транзиторного бактерионосительства.

Выделение из крови при соблюдении всех правил асептики условно-патогенных микроорганизмов (эпидермальный стафилококк, кишечная палочка) и даже сапрофитов следует считать проявлением бактериемии, особенно если эти микробы обнаружены больше чем в одной пробе материала или в разных субстратах (кровь, моча), поскольку при снижении иммунореактивности организма эти и другие «непатогенные» микроорганизмы могут быть возбудителями инфекционных процессов, в том числе и сепсиса.

Определенную сложность представляет трактовка результатов бактериологического исследования нестерильных сред , а именно доказательство этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. В этом случае учитывают в комплексе такие показатели, как вид выделенных культур, количество микробных клеток данного вида в материале, повторное их выделение в течение заболевания, присутствие монокультуры или ассоциации микроорганизма.

Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.

ЦЕЛЬ:

1. Изучить методы выделения чистых культур бактерий

2. Овладеть бактериологическим методом диагностики инфекционных заболеваний.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА

Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний. Его сущность – определение вида возбудителя инфекции, следовательно, на основании результатов бактериологического метода можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основным недостатком метода является длительность исследования – от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.

Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдение ряда правил.

1. Забор исследуемого материала необходимо провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы антибиотика. Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды необходимо соблюдать строжайшую асептику. Для этого использовать стерильный материал: а) ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа); б) проволочную петлю для взятки материала из влагалища, анального отверстия; в) шприц для взятия крови, гноя; г) стерильную посуду для непосредственного сбора в нее мочи, мокроты, испражнений.

2. Транспортировку полученного материала следует производить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах.

3. Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:

Фамилия, имя, отчество, возраст пациента;

Предполагаемый диагноз заболевания;

Предшествующая антимикробная терапия;

Характер материала;

Дата и время взятия материала;

Цель исследования;

Название лечебного учреждения, номер отделения, палаты;

Подпись лечащего врача.

Бактериологический метод осуществляется в два этапа (рис.2.1.):

1. Выделение чистой культуры возбудителя (1-2 суток);

2. Идентификация чистой культуры (1-3 суток).

На первом этапе проводится посев исследуемого материала на твердую или в жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств, отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар. Этап идентификации включает обязательное изучение морфологии, биохимических свойств и антигенной структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучения патогенности и персистентных свойств.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:

1. Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования.

2. Правила оформления направления на бактериологическое исследование.

3. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

4. Бактериологический метод диагностики. Цель. Этапы. Диагностическая ценность.

ПЛАН САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ:

1. Изучить таблицы «Методы выделения чистых культур бактерий» и «Выделение и идентификация чистой культуры».

2. Выделить из смеси бактерий чистую культуру и осуществить ее идентификацию – овладеть бактериологическим методом диагностики (Работа 1)

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать принципы культивирования микроорганизмов, питательные среды, их классификация; методы стерилизации и дезинфекции, применяемые в микробиологии и медицине; этапы бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний.

уметь пользоваться аппаратурой для культивирования бактерий (аэробов и анаэробов), выбрать средства, режим стерилизации и дезинфекции в соответствии с конкретными задачами, проводить 1 этап бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний (посевы исследуемого материала на плотные и жидкие питательные среды с целью выделения чистых культур аэробных микроорганизмов).

1. Вопросы для самоподготовки:

1. Состав и требования, предъявляемые к питательным средам

2. Классификация питательных сред

3. Асептика и антисептика

4. Дезинфекция, методы и контроль эффективности дезинфекции

5. Стерилизация, методы, аппаратура и режимы стерилизации

6. Методы определения эффективности стерилизации

7. Вид, штамм, колония, чистая культура микроорганизмов

8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов

9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Цель и последовательность выполнения 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов

10. Техника посева микроорганизмов на жидкие и плотные питательные среды

11. Особенности культивирования анаэробных микроорганизмов. Аппаратура и оборудование, используемая для культивирования анаэробных бактерий

2. Контрольные вопросы:

1) Выписать требования, предъявляемые к питательным средам

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2) Выписать классификацию питательных сред

а) по консистенции (с примерами, указать концентрацию агар-агара): ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) по целевому назначению (дать определение, привести примеры)

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3) Выписать методы стерилизации

а) с использованием высоких температур ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) без использования высоких температур ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4) Перечислить аппаратуру для стерилизации ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5) Выписать в тетрадь а) методы контроля режима стерилизации

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) методы контроля стерильности питательных сред ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

в) методы контроля стерильности инструментов, перевязочного, шовного материала и др. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6) Перечислить все методы культивирования аэробов

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7) Перечислить все методы культивирования анаэробов

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8) Изучить схему бактериологического метода диагностики, назвать этапы метода

Выписать цель и схему бактериологического метода исследования

ЦЕЛЬ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ознакомиться с питательными средами и заполнить таблицу «Питательные среды».

Заполните таблицу «Основные методы стерилизации»

Базовый текст

Состав и требования, предъявляемые к питательным средам

Пи­тательные среды необходимы для получения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, а также для сохранения мик­роорганизмов в виде чистых культур в лабораторных и производственных условиях.

Питательная среда должна удовлетворять сле­дующим требованиям:

1. Питательность (полноценность) - содержание необходимых для жизнедеятельности микробов факторов – источников углерода, азота, серы, источников энергии, необходимых неорганических ионов в форме доступной для усвоения микроорганизмами.

2. Изотоничность, создаваемая 0,85% NaCl (концентрация солей в питательной среде должна соответствовать их концентрации в микробной клетке).

3. Оптимальные значения ряда биохимических показателей: концентрации водородных ионов (диапазон рН 4,5-8,5, обычно 7,2-7,4), окислительно-востановительного потенциала (Eh для анаэробов – низкий 0,0120-0,060 В, для аэробов – высокий более 0,080 В), осмотического давления.

4. Иметь достаточную влажность (не менее 60% для плотных сред), так как микробы пита­ются по законам диффузии и осмоса.

5. Определенная вязкость (наиболее оптимальная для диффузии веществ).

6. Прозрачность, для визуализации роста бактерий.

7. Стерильность.

Компоненты питательных сред

Источ­ником азота для микроорганизмов являются белки, но большинство мик­робов неспособны усваивать нативный белок, поэтому используются про­дукты кислотного и ферментного расщепления белка: пептон, казеин. Исходными компонентами искусственной питательной среды является мясная вода, кислотный и ферментный гидролизат казеина, пептон, также к основе добавляют хлорид натрия. Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины. Казеин пищевой кислотный является отходом молочной промышленности, содержит полноценный набор аминокислот и характеризуется высокой питательностью. Пептон – это продукт неполного переваривания белка, получаемый путем ферментного или кислотного гидролиза отходов производства мясных или рыбных продуктов или молочного казеина. Содержит альбумозы, пептоны и полипептиды аминокислот в незначительном коли­честве, состав их зависит от глубины расщепления белка. Пептон представляет собой порошок светло-желтого цвета, хорошо растворяется в воде, не свертывается при нагревании. Используется как источник азота и углерода.

Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар – продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Он способен образовывать в воде гели, плавящиеся при 100°С и уплотняющиеся при 45°С и ни­же, не используемые микроорганизмами в качестве пи­тательного субстрата. Несколько циклов плавления и за­твердевания не влияют на способность агара образовы­вать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать.

Также в состав питательных сред включают кровь, сыворотки, неорганические соли. Все питательные среды, как правило, содержат 0,5 % хлористого натрия, что соответствует изоосмотическим условиям среды, оптимальным для жизнедеятельности микробов. Функцией минеральных элементов в метаболизме микробов является в основном активация различных ферментов. Кроме того, неорганические ионы (в основном Na+ и К+) участвуют в транспорте веществ через клеточные мембраны, в регуляции синтеза белка.

Восстанавливающие вещества. Восстанавливающие вещества добавляют в среды, предназначенные для культивирования анаэробных микроорганизмов, чтобы снизить окислительно-восстановительный потенциал (Eh) и сбалансировать его на оптимальном уровне. Eh - это мера способности раствора отдавать или принимать электроны. При культивировании анаэробов в качестве восстановителей обычно применяют тиогликолят натрия (0,1 %), цистеин (0.1%), аскорбиновую кислоту (0,1 %).

Углеводы, многоатомные спирты, индикаторы . Углеводы являются наилучшим источником углерода для большинства гетеротрофных микроорганизмов. Они входят в состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для определения биохимических свойств микробов.

В состав питательных сред, кроме углеводов и многоатомных спиртов, входят различные индикаторы , в основном кислотно-основные. Изменение цвета среды при посеве микроорганизмов указывает на образование кислоты или щелочи при ферментативной активности микроорганизмов. В качестве индикаторов обычно используют нейтральный красный, бромтимоловый синий, конго красный, смесь розоловой кислоты и водно-голубого (ВР), индикатор Андреде.

Красители. Способность красителей легко и обратимо переходить из окрашенной формы в восстановленную (бесцветную) широко используется в бактериологической практике, в частности, для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу, от лактозоотрицательных. В результате указанного процесса лактозоположительные бактерии образуют на среде окрашенные колонии, а лактозоотрицательные – бесцветны. Наиболее употребительными красителями, входящими в состав питательных сред, являются основной фуксин, метиленовая синь и эозин.

Ингибиторы. При исследовании на наличие патогенных бактерий необходимо подавить рост сопутствующей микрофлоры. С этой целью используют различные ингибиторы. В качестве ингибиторов грамотрицательных микроорганизмов в состав сред входят тетратионат натрия и калия, теллурит калия, ацетат таллия, сульфат таллия, селенит натрия. Для угнетения роста грамположительных микробов используются анилиновые красители: бриллиантовый зеленый, кристаллический фиолетовый, этиловый фиолетовый, анилиновый синий. Желчь и соли желчных кислот входят в состав селективных сред для выращивания патогенных энтеробактерий. Смесь желчных кислот, получаемая в результате щелочного гидролиза желчи, входит в состав среды Плоскирева. За рубежом в составе селективных сред используют соли отдельных желчных кислот, в основном дезоксихолат натрия.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред - один из наиболее ответственных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов. Они представляют со­бой гигроскопические порошки с влажностью до 10%. Го­товят среды по прописи, указанной на этикетке. Постоянство состава, стан­дартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуще­ством сухих питательных сред. После установления соответствую­щего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.

Вид - совокупность микроорганизмов, имеющих общее эволюционное происхождение, близкий генотип (высокую степень генетической гомологии, как правило более 60%) и максимально близкие фенотипические характеристики. Штамм – выделенная культура данного вида бактерий («конкретный образец данного вида) Колония – видимая глазом изолированная структура, образующаяся в результате размножения и накопления м/о за определенный срок инкубации и из одной родительской клетки или из нескольких идентичных клеток.

Методы лабораторной диагностики Ø Микроскопический – обнаружение м/о непосредственно в клиническом материале Ø Бактериологический – выявление м/о путем посева материала на питательные среды Ø Биологический – выделение м/о из предварительно зараженного лабораторного животного Ø Серологический –выявление специфических иммунных антител в сыворотке крови больного Ø Аллергический –постановка кожно-аллергических проб (узко специфичен – туберкулез, туляремия и др.)

Ø Культуральные - характер роста микроорганизма на питательных средах. Ø Биохимические - способность ферментировать различные субстраты (углеводы, белки и аминокислоты и др.), образовывать в процессе жизнедеятельности различные биохимические продукты за счет активности различных ферментных систем и особенностей обмена веществ. Ø Антигенные - зависят преимущественно от химического состава и строения клеточной стенки, наличия жгутиков, капсулы, распознаются по способности макроорганизма (хозяина) вырабатывать антитела и другие формы иммунного ответа, выявляются в иммунологических реакциях.

Физиологические- способы углеводного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) и других видов питания, тип дыхания (аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы). Ø Подвижность и типы движения. Ø Способность к спорообразованию, характер спор. Ø Чувствительность к бактериофагам, фаготипирование. Ø Химический состав клеточных стенок - основные сахара и аминокислоты, липидный и жинокислотный состав. Ø Белковый спектр (полипептидный профиль). Ø Ø Чувствительность к антибиотикам и другим лекарственным препаратам. Ø Генотипические (использование методов геносистематики).

Бактериологический метод включает посев клинического материала на искусственные питательные среды, выделение чистых культур микробов и их последующую идентификацию.

Бактериологические методы используются: в диагностике инфекционных заболеваний; Ш При профилактических обследованиях на носительство бактерий кишечной группы, дифтерийной палочки и др. ; Ш при изучении санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды (вода, воздух, почва, продукты питания и др.) и исследовании их по эпидемиологическим показаниям на зараженность патогенными видами микроорганизмов. Ш

Физиологическая характеристика Отношение к температуре Дыхание Питание Ферменты Метаболизм белков и аминокислот (желатиназа, коллагеназа, декарбоксилазы, уреаза) Другие ферменты (гемолизины, липазы, лецитиназа, ДНКаза) Конечные продукты метаболизма (хроматография) Устойчивость/чувствительность к АМП

Элементы, которые в первую очередь необходимы для роста микроорганизмов и должны включаться в состав питательной среды, определены из химического состава микробных клеток, который, в принципе, одинаков у всех живых организмов. Основная часть общей массы клеток представлена водой (80 – 90%) и только 10 – 20% приходится на сухое вещество. По количественному содержанию в сухом веществе выделяют макро- и микроэлементы. К числу первых относятся: углерод, кислород, азот, водород, сера, фосфор, калий, натрий, магний, кальций, железо. К микроэлементам –– марганец, молибден, цинк, медь, кобальт и др. , большинство из которых необходимо в следовых количествах. По этой причине в состав многих сред микроэлементы не добавляют, так как потребность в них может быть удовлетворена за счет примесей в солях макроэлементов. Кроме того, не все микроорганизмы нуждаются в микроэлементах. 14

В отличие от животных и растительных организмов, микроорганизмы характеризуются разнообразием и типов питания, которые выделяют по трем основным критериям –– источник углерода, источник энергии и донор электронов (водорода). В зависимости от природы источника углерода все микроорганизмы разделены на 2 большие группы –– автотрофы, использующие углекислоту, и гетеротрофы, требующие для роста и размножения готовых органических веществ. С учетом разнообразия источников энергии и доноров электронов эти группы подразделены на подгруппы, в результате чего у микроорганизмов выделены 8 типов питания. Каждый тип питания характерен для определенных микроорганизмов и отражает их физиологобиохимические свойства. Большинство микроорганизмов, в том числе и патогенных, имеют тип питания, при котором источником углерода, энергии и донорами электронов являются органические вещества. 16

Потребности микроорганизмов в органических источниках углерода весьма разнообразны. Некоторые виды являются ≪всеядными≫ и могут потреблять различные по химической природе вещества, другие отличаются большей избирательностью и используют лишь некоторые из них. Специфичность набора органических соединений, свойственного каждому виду микроорганизмов, учитывается при создании элективных и дифференциально-диагностических сред, широко применяемых в санитарной и клинической микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов. При выборе углеродсодержащего субстрата необходимо учитывать, что усвояемость органических веществ в значительной степени зависит и от их свойств –– растворимости, степени окисленности атомов углерода, пространственной конфигурации и полимеризации их молекул. Обычно микроорганизмы усваивают определенные оптические изомеры –– сахара, относящиеся к D-ряду, аминокислоты –– к L-ряду. Очень мало микроорганизмов обладают ферментами, под действием которых один оптический изомер превращается в другой. Использовать такие биополимеры как крахмал, полисахариды, белки, жиры могут только те микроорганизмы, у которых синтезируются определенные гидролитические ферменты –– амилазы, протеазы, липазы в форме экзоферментов, т. е. ферментов, выделяемых клеткой в среду обитания. 17

Для подавляющего большинства гетеротрофных микроорганизмов основными, легко доступными источниками углерода и энергии являются углеводы, аминокислоты, белки, органические кислоты. Характеризуя потребность микроорганизмов в органических источниках углерода следует отметить, что наибольшая степень гетеротрофности присуща патогенным микроорганизмам, приспособившимся к жизни в организме человека и животных. Состав питательных сред для их культивирования особенно сложен. Они содержат белки или продукты их неглубокого гидролиза (пептиды), витамины, фрагменты нуклеиновых кислот и др. Для приготовления таких сред используют различного типа гидролизаты и экстракты мяса, кровь или сыворотку, дрожжевые и растительные экстракты и многое другое. Эти среды пригодны для культивирования самых разных видов и особенно удобны в тех случаях, когда неизвестна потребность микроба в факторах роста или он нуждается во многих факторах роста одновременно. Недостатком таких сред является сложность или невозможность достижения их стандартности из-за нестандартности и ограниченной контролируемости состава и свойств исходного сырья. 18

Конструктивный метаболизм микроорганизмов в целом направлен на синтез четырех основных типов биополимеров –– белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Для биосинтеза белков и нуклеиновых кислот важнейшим элементом, кроме углерода, является азот. Самым доступным источником азота для большинства микроорганизмов являются ионы аммония, которые они могут получать из солей органических и неорганических кислот, аминокислот, белков и других азотсодержащих веществ. Для многочисленной группы бактерий, главным образом патогенных, в качестве источников азота необходимы азотсодержащие органические вещества. Если таким источником азота являются аминокислоты, микроорганизмы могут их использовать непосредственно для синтеза белков, либо предварительно осуществить их дезаминирование, а выделившиеся при этом аминогруппы использовать для синтеза собственных аминокислот, белков. 19

Однако, для роста некоторых микроорганизмов необходимы определенные аминокислоты, которые они не могут синтезировать сами. К числу микроорганизмов, нуждающихся в таких ≪незаменимых≫ аминокислотах, относятся золотистый стафилококк, гемолитический стрептококк, молочнокислые бактерии и некоторые другие. В зависимости от физиологических особенностей микробов, количество ≪незаменимых≫ аминокислот различно –– для золотистого стафилококка обязательно наличие в питательной среде лишь триптофана и цистина, а для гемолитического стрептококка –– 17 аминокислот. Белки, как источники азота, доступны только тем микроорганизмам, которые образуют протеолитические ферменты, выделяемые в среду (т. е. в экзоформе). Под действием этих ферментов белки расщепляются до более низкомолекулярных веществ –– пептонов и аминокислот. 20

Энергетический метаболизм микроорганизмов, как и конструктивный, характеризуется разнообразием биохимических механизмов. В этом метаболизме различают три основных типа ––аэробное дыхание, анаэробное дыхание и брожение, наиболее распространенным из которых является аэробное дыхание. В этом процессе органическое вещество окисляется до углекислоты и воды с максимальным выделением энергии, заключенной в этом веществе. Многие микроорганизмы с аэробным дыханием –– строгие аэробы, однако некоторые из них относятся к факультативным аэробам, поскольку они могут образовывать АТФ и в анаэробных условиях ––путем брожения. Некоторые микроорганизмы, главным образом бактерии, получают энергию в анаэробном дыхании, т. е. в результате окисления веществ, где в качестве акцепторов электронов выступает не кислород, а неорганические соединения. Так, отдельные виды рода Bacillus, E. coli осуществляют анаэробное дыхание, в процессе которого нитрат (NO 3) восстанавливается до аммиака; Clostridium aceticum окисляет молекулярный водород, используя в качестве акцептора электронов углекислоту. 21

Простейшим по метаболизму типом энергетического метаболизма является брожение. Процессы брожения протекают в анаэробных условиях и сопровождаются выделением энергии. Основным субстратом брожения являются углеводы, однако бактерии могут сбраживать органические кислоты, в том числе и аминокислоты, а также пурины и пиримидины. Известно много типов брожения, каждый из которых вызывается особой группой микроорганизмов и в соответствии с механизмом сопровождается образованием специфических конечных продуктов. Конечными продуктами брожений обычно являются различные органические кислоты –– молочная, уксусная, янтарная, лимонная и др. , а также спирты (этиловый, бутиловый, пропиловый), углекислый газ и водород. По выходу основного конечного продукта выделяют и соответствующие типы брожения. В силу того, что при брожении не происходит полного окисления субстрата и в среду выделяются частично окисленные вещества, еще содержащие энергию –– органические кислоты, спирты и др. , общий выход АТФ в этом процессе на 1 моль сбраживаемого субстрата значительно (~ в 30 раз) ниже, чем при метаболизме того же субстрата в процессах дыхания. 22

Особая роль принадлежит Роберту Коху. Постулировав необходимость выделения чистой культуры микроба, он тем самым определил необходимость создания условий для решения этой задачи. Важнейшим из них явилась питательная среда, на которой можно было бы получить рост микроорганизма. С именем Коха связывают внедрение в микробиологическую практику в 1881 г. плотных питательных сред. Сама идея их использования возникла раньше и принадлежит немецкому исследователю Бредфельду. Более того, еще в 1877 г. Шретер культивировал бактерии на ломтях картофеля, что также может трактоваться как применение питательной среды. Заслуга Коха заключается в глубоком научном подходе к проблеме, широком использовании питательных сред в собственных исследованиях. Им же предложен первый отвердитель –– желатин, как компонент плотной среды. 25

Привычный для современных микробиологов агар-агар был внедрен Фростом в повседневную практику значительно позже, в 1919 г. , хотя справедливо было бы вспомнить, что еще в 1881 г. Немецкая исследовательница Хессе предложила агар-агар. Более того, в 1913 г. русский микробиолог В. Л. Омелянский, отдавая должное питательным средам с желатином, отмечал, что агаризованные питательные среды предпочтительнее в тех случаях, когда микроб разжижает желатин. Идеи и практическая деятельность Коха получили в конце 19 и первой четверти 20 столетий интенсивное развитие. Именно в этот период исследователи ряда стран предложили питательные среды различного назначения, роль которых для практической микробиологии была и остается весьма значительной. Современный микробиолог каждый день в своей работе вспоминает их имена. В эти немногие годы японец по происхождению Ш. Эндо предложил свой агар для дифференциации энтеробактерий, австриец Э. Левенштейн –– среду для микобактерий, англичанин А. Мак. Конки –– селективную и дифференциально-диагностическую среду для кишечных микроорганизмов, немец Т. Китт и итальянец Д. Тароцци –– среду для облигатно анаэробных бактерий, француз Р. Сабуро, чех Ф. Чапек и американец А. Докс ––– среды для грибов, бразилец Р. Хоттингер –– среды широкого назначения на основе перевара мяса и т. д. 26

Общие требования Содержание всех элементов для построения микробной клетки Достаточная влажность Обеспечение изотонии Определенная концентрация водородных ионов Окислительно-восстановительный потенциал Стерильность

Основные фазы роста периодической культуры: начальная (лаг-) – 1, экспоненциальная (або логарифмическая) – 2 , стационарная - 3 отмирания – 4 (рис. 12) Рис. 12. Основные фазы роста микробной популяции на жидких питательных средах.

Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах Ø Ø Ø Рост бактерий с равномерным помутнением среды, цвет которого не изменяется или изменяется в соответствии с цветом водорастворимого пигмента, образующегося в культуре микроба; Придонный рост бактерий – образование осадка (скудного или обильного, крошковидного, гомогенного, волокнистого и др.); Пристеночный рост с сохранением прозрачности питательной среды; Поверхностный рост бактерий – пленка на поверхности среды (тонкая, нежная, бесцветная или влажная, толстая хорошо видимая невооруженным глазом, плотная сухая со сморщенной, а иногда бородавчатой поверхностью); Цвет пленки, как и питательной среды, зависит от пигмента, вырабатываемого растущей культурой микроба.

Характер роста микроорганизмов на полужидких питательных средах Исследуемая культура засевается в столбик 0, 2 – 0, 5% полужидкий агар. Определяется способность микроорганизма к движению – распространение от места посева (укола) в среду уколом в непосредственной близости от стенки пробирки.

Среда Эндо Дифференциально-диагностическая Состав: Основа – питательный агар Диф. фактор – лактоза Индикатор – основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия Рост лактозо + колоний красного цвета с металлическим блеском

Среда Плоскирева Селективная, дифференциально-диагностическая Состав: Основа – питательный агар Элективный фактор – желчные соли, бриллиантовый зеленый, йод Диф. фактор – лактоза Индикатор – нейтральный красный Рост лактозо + колоний брусничного цвета

Солевой агар Элективная среда Состав: Основа – питательный агар Элективный фактор – соль 10% Индикатор – нет Рост колоний, устойчивых к соли

Желточно-солевой агар (Чистовича) Элективная, диагностическая Состав: Основа – питательный агар Элективный фактор – соль 10% Диф. фактор –желток яйца Индикатор – нет Рост колоний, устойчивых к соли, + помутнение вокруг колоний за счет лецитовителлазной активности

Тетратионатная среда Мюллера-Кауфмана Среда предназначена для селективного обогащения при выявлении бактерий рода Salmonella Состав: Основа – питательный бульон Элективный фактор – соль селинистой кислоты Индикатор – нет Рост бактерий, устойчивых к селинисто-кислому натрию

Солевой бульон Элективная среда Состав: Основа – питательный бульон Элективный фактор – 6. 5% Na. Cl Индикатор – нет Рост микроорганизмов, устойчивых к соли

Характер роста микроорганизмов на плотных питательных средах. Основные признаки: ü Размер – точечные (≤ 1 мм) – крупные (4 – 6 мм и более); ü Форма - правильная(круглая); неправильная (амебовидная), ризоидная; ü Контуры края – ровные или неровные(фестончатые, волнистые и др.) ü Рельеф колоний (куполообразные, плоско-выпуклые, колонии с вдавленным центром и др. ü Поверхность колонии (матовая или блестящая (S- R- формы); ü Цвет колонии (пигментообразование); ü Структура колонии (мелко- или грубо зернистые); ü Консистенция (вязкие, слизистые, пастообразные и др.

Пигментообразование бактерий Красно-коричневый (продигиозин) Serratia marcessens Желто-оранжевый, (каратиноиды) Рода Staphylococcus, Sarcina, M. tuberculosis Черный, бурый (меланин) B. cubtilis, Грибы рода Candida Синий (пиоцианин) P. aeruginosa Флюоресцирующий Желто-зеленый (пиовердин) Род Vibrio

Выделение чистых культур: фильтрация через мембранные фильтры Микроорганизмы на фильтре Металлические обоймы для ядерных фильтров